DNA Sequenzierung nach Sanger

Die DNA-Sequenzierung ist die Bestimmung der Nukleotid-Abfolge in einem DNA-Molekül. Die bis vor kurzem gängigste Methode der DNA-Sequenzierung war die Methode nach Sanger. Diese Methode wird auch Kettenabbruch-Sequenzierung oder Didesoxymethode genannt. Namensgeben war hier die Verwendung modifizierter Bausteine der DNA-Synthese, die sogenannten ddNTPs bzw. Didesoxy-Nukleotide. Sie besitzen keine freie 3'-Hydroxygruppe. Werden sie in den neusynthetisierten Strang eingebaut, ist eine Verlängerung der DNA durch die DNA-Polymerase nicht mehr möglich. Prinzipiell läuft die DNA-Sequenzierung nach Sanger wie eine PCR ab. Anders als in der PCR wird bei der DNA-Sequenzierung nur ein Primer zugegeben, der durch Anhängen der dNTPs solange verlängert wird, bis an Stelle eines dNTPs ein ddNTP als Baustein verwendet wird. Da bei den ddNTPs die freie 3´-OH Gruppe fehlt, kann kein weiteres Nukleotid angefügt werden, die Verlängerung bricht hier ab. Die entstandenen unterschiedlich langen Einzelstränge, die jeweils mit einem mit einem spezifischen Fluoreszenz-Farbstoff markierten ddNTP enden, werden anschließend in einem Kapillarsequenzierer (ABI3730, Thermo Fisher Scientific) elektrophoretisch aufgetrennt.

Die Auswertung der Sequenzen erfolgt mit dem SEQPATIENT® Modul der Sequence Pilot Software (JSI medical Systems; https://jsi-mediysy.de).

Die Sanger-Sequenzierung wird für die gezielte Analyse von PCR-Amplikons eingesetzt. Typischerweise werden Amplikons bis zu 400 Basenpaare in beiden Richtungen sequenziert. Sie ist gut automatisierbar, stößt jedoch in der Routine an ihre Grenzen bei der Sequenzierung großer Gene oder bei Fragestellungen, die eine Vielzahl von Zielgenen beinhalten.