In-vitro Synthese mittels PCR (Polymerase-Ketten-Reaktion)

In der molekulargenetischen Diagnostik ist die Polymerase-Ketten-Reaktion, mit deren Hilfe eine bestimmte Gen-Sequenz vervielfältigt werden kann, eine grundlegende Methode und auch Voraussetzung für verschiedene weitere Methoden und Analyseverfahren. Für die Vervielfältigung eines definierten Genabschnitts wird das Enzym DNA-Polymerase verwendet. Der PCR-Prozess besteht aus etwa 20–50 Zyklen und jeder Zyklus besteht aus drei Schritten. Die Bezeichnung Kettenreaktion bedeutet, dass die Produkte vorheriger Zyklen als Ausgangstemplate für den nächsten Zyklus dienen und somit eine exponentielle Vervielfältigung ermöglichen.

Die drei Schritte sind:

1. Denaturierung (Melting, Schmelzen): Zunächst wird die doppelsträngige DNA auf 94–96 °C erhitzt, um die Stränge zu trennen.

2. Primerhybridisierung (Primer annealing): Die Primer sind kurze, einzelsträngige DNA-Fragmente, die spezifische sich an die zu amplifizierende DNA-Sequenz anlagern. (54-64°C abhängig von der Länge und Sequenz des Primers).

3. Elongation (Extension, Polymerisation, Verlängerung, Amplifikation): In diesem Schritt ergänzt die DNA-Polymerase ausgehend vom 3'-Ende des angelagerten Primers die DNA wieder zum Doppelstrang (70-72°C abhängig von der verwendeten (hitzestabilen) DNA-Polymerase).